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蛋白穩(wěn)定性分析時(shí)大分子聚集狀態(tài)解析
點(diǎn)擊次數(shù)：292 更新時(shí)間：2025-10-20
在生物制藥、食品工業(yè)和基礎(chǔ)研究中，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是衡量其功能與壽命的核心指標(biāo)。然而，許多蛋白在儲(chǔ)存、運(yùn)輸或加工過(guò)程中會(huì)“抱團(tuán)”形成聚集體，這些從納米級(jí)寡聚體到微米級(jí)顆粒的“大分子俱樂(lè)部”，往往直接導(dǎo)致藥效下降、免疫原性上升或溶液渾濁。如何看清這些聚集體的“真身”，成為蛋白穩(wěn)定性分析的關(guān)鍵戰(zhàn)役。
一、為什么聚集是穩(wěn)定性“紅燈”？
蛋白質(zhì)聚集本質(zhì)上是疏水核心暴露后分子間“牽手”的結(jié)果。溫度波動(dòng)、pH漂移、離子強(qiáng)度變化或表面吸附，都可能讓原本折疊緊湊的蛋白展開(kāi)，暴露β-片層等“粘性”區(qū)域。一旦形成二聚體、三聚體，就像滾雪球般形成不可逆纖維（如淀粉樣纖維）或無(wú)定形顆粒。研究顯示，單抗藥物中只要0.01%的聚集體，就可能觸發(fā)患者免疫反應(yīng)，導(dǎo)致療效喪失。
二、傳統(tǒng)“放大鏡”的盲區(qū)
早期分析依賴SDS-PAGE或SEC（尺寸排阻色譜），只能檢測(cè)變性后或稀釋狀態(tài)下的聚集體，容易低估真實(shí)水平。如SEC可能因柱材吸附導(dǎo)致弱結(jié)合寡聚體“漏網(wǎng)”；而濁度法雖能感知顆粒，卻無(wú)法區(qū)分蛋白聚集與脂質(zhì)氣泡。更棘手的是，亞可見(jiàn)顆粒（0.1–10μm）恰好處于光學(xué)顯微鏡與光散射的“盲區(qū)”，如同隱形危機(jī)。
三、新技術(shù)給聚集體拍“CT”
1.非對(duì)稱流場(chǎng)-流分離
像“分子跑步機(jī)”般按流體力學(xué)半徑分離，可原位檢測(cè)未稀釋樣品中的nm-μm級(jí)聚集體，避免SEC的剪切力破壞。聯(lián)用多角度光散射，直接計(jì)算分子量，區(qū)分“緊密球”與“松散鏈”。
2.納米顆粒跟蹤分析
通過(guò)激光散射追蹤單個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，像“星空攝影”般統(tǒng)計(jì)0.01–1μm顆粒的濃度與粒徑分布，彌補(bǔ)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)蛋白顆粒的靈敏度不足。
3.微流控?cái)U(kuò)散篩選
利用芯片上微尺度擴(kuò)散差異，在原生條件下（無(wú)需標(biāo)記）區(qū)分單體與寡聚體，僅需5μL樣品，10分鐘完成掃描，成為早期配方篩選的“快檢利器”。
4.冷凍電鏡
對(duì)“疑難雜癥”如可逆寡聚體，通過(guò)快速冷凍捕獲瞬時(shí)結(jié)構(gòu)，近原子級(jí)分辨率揭示聚集界面。
